Improving Strength, Power, Muscle Aerobic Capacity, and...

来自 : www.jove.com/t/55518/verbesser 发布时间：2021-03-25

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Die Regionale Ethik-Komitee von Stockholm, Schweden, genehmigt die Gestaltung der Untersuchung.

1. Material

Rekrutieren Sie relativ gesunde Frauen und Männer 65-80 Jahre alt, die BMI Werte zwischen 20 und 30 kg · m -2 haben . Randomisieren sie in zwei Gruppen. Stellen Sie sicher, dass die Personen in beiden Gruppen relativ niedrige körperliche Aktivität Ebenen ( dh moderate tägliche körperliche Aktivität und keine regelmäßige Bewegung Ausbildung). Exklusive Beta-Blocker-Benutzer und solche mit koronarer Herzkrankheit und schwere neurologische oder Gelenkprobleme. Fragen Sie die Unterlagen nach schriftlicher Zustimmung, nachdem Sie sie über mögliche Unannehmlichkeiten und Risiken in den Test- und Schulungen informiert haben. Gleichgewicht der Widerstandstraining (RET) und Kontrolle ohne Training (CON) Gruppen in Bezug auf Alter, Geschlecht und BMI. Bitten Sie eine Gruppe, RET unter einem Trainer für 1 Stunde dreimal pro Woche für acht Wochen durchzuführen; Die andere Gruppe wird als contro dienenLs (CON).

2. Prüfung und Schulung

Anmerkung: Die acht Übungen sind Standard-Krafttrainingsübungen: Sitzende Beinpresse, sitzende Bauchknirschen, Rückenlehnen-Brustdrücken, Rückenlehnenverlängerung, sitzende Schulterpresse, sitzendes Rudern, sitzende Beinverlängerung (Knieverlängerung) und anfällige Beinaufwicklung (Kniebeugung) ; Siehe Abbildung 8 im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.

Während der ersten Trainingseinheit beurteile die maximale Stärke bei einer maximalen Wiederholung (1 RM) für jede Trainingsübung.
HINWEIS: Das 1 RM-Modell wird häufig verwendet und ist definiert als die Last, bei der das Motiv den Widerstand nur einmal, aber nicht zweimal anheben oder drücken kann. Vor dem Start, bitten Sie den Teilnehmer, ein kurzes Aufwärmen (mit ein paar anfänglichen Versuchen bei sehr geringen Gewicht Lasten) der getesteten Übung durchzuführen. Anschließend erhöhen Sie die Belastung bis knapp unter dem wahrscheinlichen 1 RM-Wert (meistens das Maximum von 3-4 erhöht loAnzeigen). Registrieren Sie die maximale Belastung, die der Betreff nur einmal ausführen kann (= 1 RM). Messen Sie 1 RM in den acht Standard-Krafttrainingsübungen (siehe Abbildung 8 im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse). Fragen Sie die Unterrichtsstunden für mindestens 2-3 min zwischen jeder getesteten Übung.
ANMERKUNG: Für alle Trainingsübungen wurde Krafttrainingsausrüstung verwendet, einschließlich der Tests jeder Trainingsübung. Bitten Sie die ganze RET-Gruppe, 1 Stunde lang beaufsichtigtes Krafttraining dreimal pro Woche für acht Wochen durchzuführen. Bitten Sie die Teilnehmer, nach dem Aufwärmen die acht oben genannten Übungsübungen durchzuführen. Sie sollten eine Übung 12 mal in jedem Satz wiederholen und drei Sätze jeder Übung durchführen. Erlaube Ruhe für 1 min zwischen jedem Satz und 2-3 min zwischen jeder Übung. Fragen Sie die Unterrichtsstunden, um jede Übung so schnell wie möglich während der konzentrischen Phase ( dh Muskelverkürzung Phase) und langsam während derExzentrische Phase ( dh Muskeldehnungsphase).
HINWEIS: Themen können die Übungen in beliebiger Reihenfolge durchführen. Allerdings bitten sie sie zu beginnen und enden mit einem Bein Übung und auch zu versuchen, die acht Übungen in der vorgelegten Reihenfolge durchzuführen. Verwenden Sie Krafttrainingsgeräte für alle acht Übungen. Während jeder Trainingseinheit bitten Sie die Teilnehmer, drei Sätze bei 75-80% von 1 RM für jede Übung durchzuführen. Erhöhe die Belastung um ca. 5% die Sitzung, nachdem ein Teilnehmer 12 Wiederholungen in allen drei Sätzen einer Übung machen kann.

3. Submaximaler Zyklus Test

Hinweis: Führen Sie den submaximalen Zyklustest am Testtag 1 durch (siehe Einleitung und Abbildung 1 ).

Führen Sie einen Zyklus Ergometer Test, einschließlich zwei submaximalen Ebenen, jeweils für 4 min 14 , 15 . Setzen Sie die erste Arbeitsrate niedrig (30 W) und die zweite bei 60-120 W, ohne Pause zwischen den Lasten auf dem Zyklus Ergometer.
HINWEIS: Die erste Ladung ist für alle Fächer gleich, aber die zweite und letzte submaximale Ebene sollte etwa 65-85% der maximalen Herzfrequenz für jedes Fach sein. Beide Lasten sollten vor und nach der Interventionszeit von 8 Wochen Training gleich sein. Setzen Sie den zweithöchsten Belastungsniveau auf die Einarbeitungstests vor, die vor den Versuchen durchgeführt wurden, indem Sie fragen, wie körperlich aktiv die Person ist und indem sie das Thema zunächst für eine kurze Weile radeln; Der Testleiter wird eine Meinung bilden, die auf der Herzfrequenz des Subjekts basiert, was die endgültige submaximale Belastung angemessen ist. Die mittlere Steady-Heart Rate (HR) mit einem Herzfrequenz-Monitor über einen Brustgurt während der letzten Minute auf die niedrigen und hohen Arbeitsraten, indem sie den Mittelwert der beobachteten HR um 3:15, 3:30, 3:45 , Und 4:00 min bei jeder Arbeitsrate. Verwenden Sie eine ergo-spirometrische Vorrichtung, um die Zusammensetzung des Gases (O 2 und CO 2) zu ermitteln dh CO 2 / O 2 ) und quantifizieren Sie die RER-Mittelwerte während der letzten Minute (ab vier Maßnahmen alle 15 s) bei beiden Arbeitsgeschwindigkeitslasten.

4. Knie-Extensor-Stärke: Statisches, exzentrisches und konzentrisches Spitzen-Drehmoment und die Geschwindigkeit der Kraftentwicklung

Hinweis: Führen Sie die Kniefestigkeitsmessungen am Testtag 1 durch (siehe Einleitung und Abbildung 1 ).

Vor den Aufnahmen bitten Sie das Thema, ein Warm-up durch Zyklus für 8-10 min auf einem Zyklus Ergometer auf submaximale Ebene (dh etwa 65-85% der maximalen Herzfrequenz) durchzuführen. Bitten Sie das Thema, auf der Bank eines isokinetischen Dynamometers zu sitzen. Den Koffer des Motors mit Riemen über die Schultern und Hüften befestigen. Sichern Sie den Schaft des Motivs mit zwei Riemen sicher auf den Dynamometer-Schaft: eine unterhalb des Knies und eine gerade vorneDer Knöchel Richten Sie die Kniegelenkachse mit dem Drehzentrum der Dynamometerwelle aus. Wenn das Subjekt gesichert ist, beurteile die maximale freiwillige Kniefestigkeit als das Spitzenmoment, wobei das Subjekt im isokinetischen Dynamometer sitzt. Anfänglich erlauben Sie dem Betreff, mehrere Versuche zur Einarbeitung mit der Kniefestigkeitsausrüstung (isokinetischer Dynamometer) durchzuführen. Bitten Sie den Einzelnen, vier maximal freiwillige exzentrische und konzentrische Knieverlängerungen (abwechselnd) mit dem rechten Bein mit einer konstanten Winkelgeschwindigkeit von 30 Grad / s durchzuführen. Stellen Sie den Bewegungsbereich zwischen 90 ° und 15 ° (gerade Bein = 0 °) ein. In der exzentrischen Aufgabe bitten Sie das Motiv, der Dynamometerwelle mit maximaler Anstrengung durch die ganze Bewegung vom 15 ° bis 90 ° Kniewinkel zu widerstehen. In der konzentrischen Aufgabe bitten Sie das Subjekt, den Unterschenkel in der Dynamometerwelle in einer Knieverlängerung so hart wie möglich über den gesamten Bewegungsbereich zu drücken. Erlaube eine 4-minütige Ruhe nach den dynamischen Aufnahmen. Danach das statische maximale freiwillige Kontraktionsmoment (MVC) viermal bei einem 65 ° -Knoewinkel beurteilen. In jedem statischen Prozeß fragen Sie die Untertanen, die in demselben Dynamometer sitzen, so schnell und hart wie möglich gegen die Dynamometerwelle, die jetzt fixiert ist (bei 65 °) und kann nicht bewegt werden. Für Drehmoment- (Festigkeits-) Signale konvertieren die analogen Drehmomentsignale mit einer Analog-Digital-Wandlerbox, die mit dem isokinetischen Dynamometer verbunden ist, digital.
HINWEIS: Der Umrichter wechselt automatisch die analogen Signale vom Dynamometer in digitale Signale, die danach automatisch auf den Rechner exportiert werden, wo die Daten gesammelt werden. Setzen Sie die Abtastfrequenz bei 5 kHz im Softwareanalyseprogramm des Rechners ein. Speichern Sie die digitalen Signale auf dem Computer für eine nachfolgende Festigkeitswertanalyse mit dem Softwareanalyseprogramm. In der nachfolgenden Analyse verwendenDer höchste Wert aus vier Versuchen für jedes Fach in der exzentrischen, konzentrischen und statischen Messungen erhalten. Klicken Sie im Software-Programm auf den höchsten Wert der vier Versuche und notieren Sie den auf dem Computerbildschirm angezeigten Festigkeitswert. Registrieren Sie das höchste Spitzenmoment im Exzenter und in den konzentrischen Aufnahmen für jedes Subjekt und den höchsten Festigkeitswert unter den vier statischen Versuchen.
HINWEIS: Isokinetische Dynamometerprüfung der Knieverlängerung in sitzender Position hat die richtige Zuverlässigkeit und Gültigkeit 16 , 17 . Messen Sie die Geschwindigkeit der Kraft (Drehmoment) Entwicklung (RFD) während 0-30 ms und 0-200 ms in der höchsten Wert unter den statischen Studien gefunden. Setzen Sie den Wert von Null auf den 7,5-Nm-Pegel für den Beginn der Kontraktion für die Knie-Strecker-Stärke (Zeit: 0 ms) 18 , 19 . Bewege den Cursor (im Softwareprogramm für MuskelStärke-Analyse) auf den Wert 7,5 Nm auf der y-Skala, um die Position für 0 ms zu erhalten. Für die Vor-Test-Bewertung setzen Sie den Cursor auf den 30-ms-Wert (nach der Zeit 0 ms). Notieren Sie den Wert, der die Erhöhung in Nm bei 30 ms anzeigt ( dh die Zunahme von Nm von 7,5 Nm = 0 ms). Mache das gleiche Verfahren für den Nachprüfwert. Berechnen Sie den prozentualen Anstieg des NZ-Wertes (Zähler) im Vergleich zum Vor-Test-Nm-Wert (Nenner) über den Zeitraum von 0-30 ms. So präsentieren die RFD in Prozent von der Vor-Test bis zum Nach-Test. Machen Sie die gleichen Analysen für das Zeitintervall von 0-200 ms.

5. Muskelbiopsie

Hinweis: Führen Sie eine Muskelbiopsie am Testtag 2 durch (siehe Einleitung und Abbildung 1 ).

Nehmen Sie eine Muskelbiopsie aus dem mittleren Teil des Oberschenkel Muskel vastus lateralis mit einem Conchotom 20 . Vor der Biopsie, injizieren 1-2 ml der lokalen Anästhesie subkutan und in die Faszie. Nach ein paar Minuten, machen Sie einen Einschnitt mit einem kleinen Skalpell durch die Haut und Fascia, etwa 1/3 der Entfernung von der Patella zur vorderen oberen Iliakale Wirbelsäule. Extrahieren Sie etwa 100-150 mg Muskelgewebe mit dem Conchotom. Gefrierproben für die Histochemie in Isopentan, gekühlt auf seinen Gefrierpunkt in flüssigem Stickstoff und lagern sie bei -80 ° C. Eine Probe von 30-50 mg Muskelgewebe aufbewahren. Die Proben für die Proteinanalyse in flüssigem Stickstoff schnell einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren. Eine Probe von 30-50 mg Muskelgewebe aufbewahren.

6. OGTT

Hinweis: Führen Sie am Testtag 3 OGTT (oraler Glukosetoleranztest) durch (siehe Einleitung und Abbildung 1 ). Die Zeit zwischen der Übung und OGTT muss 48 Stunden überschreiten und sollte zwischen dem Vor- und Nachteil ähnlich sein-tests Ein 2-h oraler OGTT wird verwendet, um zu untersuchen, ob häufige Blutproben während dieser Zeit normale oder erhöhte Werte zeigen, was auf Diabetes- oder Prädiabetes-Bedingungen hindeutet.

Führen Sie den OGTT-Test am Morgen auf Themen, die über Nacht gefastet haben und haben keine anstrengende Übung am Testtag oder am Tag zuvor getan. Nehmen Sie Blutproben (4 ml) von den Rückenpartnern über eine Venenkanüle in der antecubitalen Vene 15 min vor und kurz vor der Einnahme von Glukose, gefolgt von 15, 30, 60, 90 und 120 min nach der Einnahme der Glukose ( 75 g Glucose in einer 250 g / l Lösung). Die Blutproben bei 1500 xg und 4 ° C für 10 min zentrifugieren und das Plasma bei -20 ° C für die zukünftige Analyse aufbewahren. Verwenden Sie die Proben, um Standard-Glukosespiegel-Tests durchzuführen (Schritt 7). Für Glucose, Insulin und c-Peptid berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC), indem Sie das Zeitintegral der Glukose über den basalen Glukosespiegel bestimmen. Verwenden Sie die OGTT-ErgebnisseUm die Insulinsensitivität für den ganzen Körper nach der Matsuda-Methode 21 zu berechnen, wie nach der Gleichung: 10 000 * √ [(Glucose basal * Insulin basal ) * (Glukose- Mittel * Insulin- Mittel ).

7. Blutprobenanalyse

Quantifizieren Sie die Glukosekonzentration im venösen Plasma mit einem automatisierten Analysator. Setzen Sie den beeinträchtigten Glukosetoleranzgrad bei Blutzuckerwerten 7,8 mmol / L nach einem 2-h-OGTT 22 . Verwenden Sie die ELISA-Kits 22 , um eine Plasmaanalyse von Insulin und c-Peptid durchzuführen. Verwenden Sie einen Plattenleser. Legen Sie die ELISA-Platten sowohl für Insulin als auch für c-Peptide in einem Plattenleser (jeweils separat).
HINWEIS: Der Plattenleser misst die Menge an Insulin und die Menge an c-Peptid durch Messung der Proben auf der Platte bei bestimmten Extinktionen. Die Blutlipide TG, HDL, Apolipoprotein A1 und Apolipoprotein B wurden mit Standardmethoden analysiertDas Universitätsklinikum Karolinska, Stockholm, Schweden.

8. Analyse von Muskelproben

Immunoblotting Zuerst die Muskelprobe in einem Lyophilisator bei einem Druck unter 10-1 mbar für 12 h einfrieren. Dissect es so, dass es frei von Blut und Bindegewebe mit einer Nadel und Pinzette unter einem Lichtmikroskop ist. Bei -80 ° C aufbewahren.
HINWEIS: Eine geeignete Menge an Muskel liegt zwischen 1 und 5 mg Trockengewicht, aber das Protokoll kann auf weniger als 1 mg, bis hin zu einzelnen Fasern eingestellt werden. Aufgrund der geringen Menge an Muskelgewebe, die in einer Biopsie vorhanden war, wurden Werte von diesem RET-Teilnehmer nicht für das Immunoblotting verwendet. Homogenisieren der Muskelproben Mit einem Mini-Bead-Schläger in eiskaltem Puffer (80 μl / mg) aus 2 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 5 mM Ethylenglykol-bis (Β-Aminoethylether) -N, N, N , N -tetraacet(EGTA), 10 mM MgCl 2 , 50 mM ß-Glycerophosphat, 1% TritonX-100, 1 mM Na 3 VO 4 , 2 mM Dithiothreitol, 20 μg / mL Leupeptin, 50 μg / ml Aprotinin, 1% Phosphataseinhibitor Cocktail und 40 μg / μL PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid). Legen Sie eine Schaufel von 0,5 mm Zirkonoxid Perlen in jedem Rohr mit dem Muskel. Puffer hinzufügen und für 2 x 1 min bei Geschwindigkeitsstufe 7-8 homogenisieren (hier maximal 10) und 4 ° C. Das Homogenat 10 min bei 10.000 x g zentrifugieren Den restlichen Überstand auf neue Röhrchen übertragen und das Pellet, das die Strukturproteine ​​enthält, verwerfen. Spektrophotometrisch bestimmen die Proteinkonzentration im Überstand mit einem handelsüblichen Kit unter Verwendung eines Plattenlesers bei 660 nm 23 . Anschließend die Proben mit 2x Laemmli-Probenpuffer und Homogenisierungspuffer (1: 1) auf eine endgültige Proteinkonzentration von 1,5 μg /# 181; L. Hitze auf 95 ° C für 5 min, um die Proteine ​​zu denaturieren. Die verdünnten Proben bei -20 ° C vor der Analyse aufbewahren. Für die Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) werden 30 μg Protein aus jeder Probe in 18-Well-Präzisionsgradientengele (4-20% Acrylamid) gegeben und die Elektrophorese bei 300 V für 30 min auf Eis durchgeführt. Äquilibrieren des Gels in Transferpuffer (25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin und 10% Methanol) für 30 min bei 4 ° C. Übertragen von Proteinen auf Polyvinylidenfluoridmembranen mit 0,2 μm Porengrößen bei einem konstanten Strom von 300 mA für 3 h bei 4 ° C. Um die gleiche Belastung und Übertragung zu bestätigen, färben Sie die Membranen mit einem vollständigen Proteinfleck 24 . Für jedes Zielprotein laden alle Proben von jedem Subjekt auf das gleiche Gel und führen alle Gele gleichzeitig aus. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei Raumtemperatur in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris-Base, 192 mM NaCl, TBS, pH 7,6), enthaltend5% fettfreie Milch. Inkubieren Sie die Membranen über Nacht mit primären Antikörpern (siehe Materialliste), verdünnt in TBS, enthaltend 2,5% fettfreie Milch und ergänzt mit 0,1% Tween-20 (TBS-TM). Nach der Injektion des primären Antikörpers die Membranen (2 x 1 min plus 3 x 5 min) mit TBS-TM waschen und mit sekundären Antikörpern (siehe Materialliste), konjugiert mit Meerrettichperoxidase, für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit TBS-TM (2 x 1 min und 3 x 10 min) erneut waschen und erneut vier weitere 5-minütige Waschungen mit TBS unterziehen. 6-12 ml chemilumineszierendes Substrat auf die Membran für 5 min auftragen. Legen Sie die Membran zwischen zwei transparenten Kunststoffplatten. Legen Sie die Membranen vor eine CCD-Kamera, die das externe Licht blockiert. Nehmen Sie serielle Belichtungen mit einem Chemilumineszenz-Kamerafilter. Verwenden Sie das Softwareprogramm, um 10 Belichtungen für 2 min zu erwerben, oder bis die Signale gesättigt sind. Verwenden Sie ein Standard-Setup, sowohl für die optischen Filter-Einstellungen tO erwerben chemilumineszenz, sowie für die linseneinstellungen. Verwenden Sie die höchste Belichtung, die nicht zur Sättigung führt und markieren Sie die Konturen des Bandes. Quantifizieren Sie die Bänder als Intensität x mm 2 mit derselben Software. Subtrahiere das Hintergrundrauschen von der Bandintensität. Präsentieren Sie die Ergebnisse relativ zum gesamten Proteinfleck und drücken Sie es als prozentuale Veränderung im Vergleich zur Baseline aus. Histochemie
HINWEIS: Die nachfolgende Histochemie-Technik basiert auf in einer früheren Publikation beschriebenen Methoden. Für die Histochemie schneiden Sie serielle Querschnitte (10 μm) bei -20 ° C mit einem Kryostaten ab. Montieren Sie die Querschnitte auf Glasscheiben, die in einer Glasküvette aufbewahrt wurden, und trocknen Sie die Biopsienscheiben bei Raumtemperatur. Vorbereitung der Pufferlösungen für jeden pH-Wert für die Vorinkubation bei pH 4,3, 4,6 und 10,3 für die ATPase-Färbung 26 . Um Kapillaren zu visualisieren, staIn den Querschnitten unter Verwendung des Amylase-PAS-Verfahrens 27 . Kalibrieren Sie einen pH-Meter durch Gießen von Kalibrierlösungen in markierte Kalibrierbecher. Drücken Sie die entsprechende Taste, um den pH-Wert aus dem Hauptmenü auszuwählen. Spülen Sie die Sonde mit entionisiertem Wasser ab und stellen Sie die Sonde in den ersten Kalibrierbecher. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Membran gibt. Messen Sie die erste Kalibrierlösung und stellen Sie dann die nächste Kalibrierlösung vor (die Anzeige wird nach der nächsten Lösung fragen). Spülen Sie die Sonde mit deionisiertem Wasser und legen Sie sie dann in den zweiten Kalibrierbecher. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Membran gibt. Messen Sie eine zweite Kalibrierlösung und fahren Sie mit der nächsten Kalibrierlösung fort. Spülen Sie die Sonde mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie in einen dritten Kalibrierbecher. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Membran gibt. Messen Sie die dritte Kalibrierlösung.
HINWEIS: Wenn die Kalibrierung erfolgt istGut, das Display zeigt kurz, 3. Puffer OK und kehrt dann zum Hauptmenü zurück. Verwenden Sie die Puffer wie folgt für die ATPase-Färbung. Zur Herstellung einer Lösung bei pH 10,3 werden zwei verschiedene Lösungen verwendet: (A) 4,50 g Glycin, 4,8 g CaCl 2 , 3,51 g NaCl und 600 ml dH 2 O und (B) 2,176 g NaOH und 540 ml Von dH 2 O. Lagern Sie die Lösungen in einem kalten Raum oder einem Kühlschrank. Benutze sie innerhalb eines Monats. Um Lösungen bei pH 4,3 und 4,6 vorzubereiten, Säurevorinkubation durchführen. Vorbereitung der Säure für die Vorinkubation unter Verwendung von 6,47 g Na-Acetat, 3,7 g KCl und 500 ml dH 2 O. Danach wird 1% ige CaCl 2 -Lösung durch Auflösen von 2,5 g in 250 ml dH 2 O hergestellt. 2 vorbereiten % CoCl 2 -Lösung durch Auflösen von 5 g in 250 ml dH 2 O. Speichern und verwenden Sie diese Lösungen wie oben erwähnt. Schließlich 0,2% Ammoniumsulfid vorbereitenMischen von 800 mgr; l 20% (NH 4 ) 2 S in 40 ml dH 2 O. Bereiten Sie diese frisch vor. Vorbereitung von Lösungen bei bestimmten pH-Werten wie folgt. Nach der Kalibrierung des pH-Meters entfernen Sie die Küvetten und Kalzium- und Kobaltchloride aus dem Kühlschrank und lassen sie sich vor dem Färben auf Raumtemperatur erwärmen. Für pH 10,3 ca. 25 ml Lösung A zu einem kleinen (ca. 70 mL) Glasbecher geben. Messen Sie den pH-Wert. Halten Sie die Lösung B, bis der erforderliche pH-Wert von 10.37 erreicht ist. Wenn die Färbung zu dunkel ist, erhöhen Sie den pH-Wert. Wenn es zu hell ist, reduzieren Sie den pH-Wert. Für pH 4,6 fügen Sie ca. 25 ml Säurevorinkubation zu einem kleinen Becherglas hinzu. Messen Sie den pH-Wert. Den pH-Wert mit 5 M Essigsäure reduzieren . Wenn das Bild des Flecks zu dunkel ist, versuchen Sie es mit erhöhtem pH-Wert zu erleichtern. Wenn es zu hell ist, verdunkeln Sie mit einem verringerten pH-Wert. Wenn die Färbung nicht hilft, versuchen Sie einen anderen pH-Wert: 4.8 instEad von 4.6 Für pH 4.3 , das gleiche wie für 4.6, aber fügen Sie mehr Essigsäure. Verringern Sie den pH-Wert, wenn der Fleck zu hell ist, und erhöhen Sie den pH-Wert, wenn er zu dunkel ist, damit die Fasern angegeben werden können. ATP-Lösung wie folgt vorbereiten 0,017 g ATP pro Küvette (10 ml) wiegen, also 0,051 g pro 3 Küvetten oder 0,068 g für 4 Küvetten. Nehmen Sie 30 ml (für 3 Küvetten, 10 ml / Küvette) der Lösung bei pH 10,3 (verwenden Sie ein Zylinder Skala Glas) und legen Sie es in ein Glas Becher mit gewogenen ATP. Mischen Sie gründlich und messen Sie den pH-Wert. Den pH-Wert mit konzentrierter HCl reduzieren, bis der pH-Wert genau 9,40 erreicht. Bei Inkubation bei verschiedenen pH-Werten ist folgendes zu beachten. 10,3 Lösung in eine Küvette geben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 9 min inkubieren. 4.3 Lösung in eine weitere Küvette geben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 4.6 Lösung in die letzte Küvette geben und 1 min bei RT inkubieren. Nach dem bevorzugten pH-WertInkubationsverfahren, den Inhalt jeder Küvette wie folgt anwenden. 15 mal mit dH 2 O waschen. Zu der Biopsieprobe ATP-Lösung (0,170 g ATP / 100 ml H 2 O) zugeben. In einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min inkubieren. 15 mal mit dH 2 O waschen. Zugabe von CaCl 2 -Lösung (1 g CaCl 2/100 ml H 2 O) zur Biopsieprobe in den Küvetten. Inkubation bei RT für 3 min. 15 mal mit dH 2 O waschen. CoCl 2 -Lösung (2 g CoCl 2/100 mL H 2 O) in die Biopsieprobe in den Küvetten geben. Inkubation bei RT für 3 min. 15 mal mit dH 2 O waschen. Setzen Sie es in (NH 4 ) 2 S Lösung für 30 s und waschen Sie sich 15 mal unter der Dunstabzugshaube. Kleben Sie die Biopsie Scheiben auf Folie Glas. Um Blasen zu vermeiden, drücke die Biopsien, aber nicht zu hart. Wählen Sie einen Bereich des Querschnitts ohne Artefakte oder Längsschnitte der Faser. Analysieren unter einer liGht mikroskop mit software. Beurteilen Sie die Querschnittsfläche (CSA), Kapillaren und Klassifizierung des Fasertyps ( dh Typ-I, IIA oder IIX) über eine Computerbildanalyse aus einem Mittelwert von mindestens 150-200 Fasern pro Biopsie. Aus einem Mikroskop-Bild von Muskelfasern im Querschnitt ist sicherzustellen, dass die drei Arten von Muskelfasern ( dh Typ-I, IIA und IIX) je nach pH-Färbung verschiedene Schattierungen von Weiß zu Grau bis Schwarz aufweisen , 4,34, 4,65 und 10,37). Beginnen Sie mit der Markierung von Typ-I-Fasern. Danach wird das Programm automatisch die anderen Typ-I-Fasern registrieren. Prüfen Sie, ob alle Typ-I-Fasern korrekt markiert sind. Um eine bestimmte Faser zu markieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Vector . Verwenden Sie den Cursor, um den Bereich für jede einzeln ausgewählte Muskelfaser zu messen. Nach der Analyse von Typ-I-Fasern fortsetzen Sie das gleiche Verfahren für Typ-IIA und Typ-IIX. Der Durchschnitt ± SEM für jede Art von Muskelfaser ( dh Typ I, IIA und IIX) hinsichtlich der Menge an Faser und der CSA für die RET- und CON-Gruppen berechnet werden.
Anmerkung: Die Querschnittsfläche (CSA), Kapillaren und Klassifizierung des Fasertyps ( dh Typ I, IIA und IIx) wurden aus einem Mittelwert von 163 ± 9 Fasern pro Biopsie beurteilt.

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